Thema

Modulation of catalytic efficiency: comparing enzymatic catalysts of phospho-ester hydrolysis

Teilprojektleiter

Dr. Stefan Fischer
Interdisziplinäres Zentrum für wissenschaftliches Rechnen (IWR)
Universität Heidelberg
Im Neuenheimer Feld 368
69120 Heidelberg

Telefon: +49-(0)6221-54-8879
Telefax: +49-(0)6221-54-8868
E-Mail: stefan.fischer@iwr.uni-heidelberg.de

Zusammenfassung

Wir schlagen eine Kombination aus computergestützter und experimenteller Chemie vor, um die katalytischen Mechanismen von speziellen, gut charakterisierten Metalloenzymen zu verstehen und dieses Verständnis zum Herstellen und Testen synthetischer Mimetika zu nutzen.

Kombinierte quantenmechanische und klassische (QM/MM) Molekülmechanik-Simulationen werden durchgeführt, um die Reaktionsmechanismen der Enzyme bzw. ihrer synthetischen Imitationen zu bestimmen.

Vorarbeiten

Um Reaktionswege in grossen Molekülen wie Proteinen zu bestimmen, bedarf es spezieller Simulationstechniken. Eine dieser Methoden ist "Conjugate Peak Refinement" (CPR), die in der Gruppe von S. Fischer weiterentwickelt wird1. Sie findet einen kontinuierlichen Weg minimaler Energien im sehr hoch-dimensionalen konformationellen Raum. Insbesondere findet sie die Übergangszustände, deren Energiebarrieren analysiert werden können, um den Mechanismus zu verstehen.

Vor kurzem wurde CPR mit QM/MM kombiniert und auf die Bestimmung des Mechanismus der ATP Hydrolyse durch das Muskel-Motorprotein Myosin angewendet2. Nebenstehendes Beispiel zeigt die Magnesium-katalysierte Hydrolyse von Pyrophosphat in Abwesenheit des Enzyms, gerechnet mit CPR und AM1 (Mg2+ und 4 Wasser wurden klassisch behandelt).

Ziele

Restriktionsenzyme

Es wurde vor kurzem gezeigt, dass in Anwesenheit von Metallionen DNA hydrolysiert wird. Ziel ist hier, sequenzspezifische synthetische Restriktionsenzyme herzustellen, die auch doppelsträngige DNA spalten können.

Dazu werden wir erst den QM/MM Reaktionsweg des sogenannten "Klenow" Proteinfragmentes der DNA Polymerase I rechnen, das ein gut charakterisiertes Modell für die enzymkatalysierte Phosphodiester-Hydrolyse ist. Dabei sind die Fragen:

  • Welche Rolle spielt das Protein?
  • Wo sitzen die H's im aktiven Zentrum?
  • Wie wird das Hydroxid aktiviert?
  • Was ist die Rolle von Metal M1?
  • Welche Metall-Eigenschaften sind wichtig?

Die Gruppe von R. Krämer (C3) hat gezeigt, dass ein Zirkoniumkomplex Dinucleotide schneiden kann. Zusätzlich wurden Metall-Chelat-Komplexe synthetisiert, in denen bis zu 15-mer Peptidnucleinsäuren (PNA) kovalent gebunden sind und die DNA-Konjugate bilden. In den Komplexen dient das Metall als aktives Zentrum zur DNA-Hydrolyse und das PNA zur Sequenzspezifizität. Als nächstes werden wir Simulationen von solchen Metall-PNA-DNA-Konjugaten durchführen (die Gruppe von J. Smith hat Erfahrung mit PNA-Simulationen3). Dabei sind die Fragen:

  • Was ist die Struktur und Flexibilität des Konjugates?
  • Lassen diese Hydrolyse zu?
  • Was ist der Mechanismus der Hydrolyse?

Kupferhaltige Oxygenasen

Das Ziel ist hier, den Mechanismus der Enzyme Tyrosinase und Catecholoxidase zu verstehen und synthetische Mimetika herzustellen.

Tyrosinase  

Catechol-oxygenase  

Zuerst werden wir den QM/MM Reaktionsweg der Katalyse durch Hämocyanin (Tyrosinaseaktivität) und durch Catecholoxygenase rechnen (neben-stehend mit dem Inhibitor Phenyl-thioharnstoff gezeigt, Schwefel in rot, Kupfer in grün). Dabei sind die Fragen:

  • Was sind die essentiellen Elemente des aktiven Zentrums?
  • Wie wird der Sauerstoff aktiviert?
  • Wie ist Phenol koordiniert?
  • Warum ergeben ähnliche aktive Zentren unterschiedliche Reaktionen?

Die Gruppe von P. Comba (C1) hat Kupfer-Komplexe mit Catecholoxygenase-Aktivität synthetisiert (hier gezeigt mit Kupfer in grün) und deren Röntgenstrukturen gelöst. Wir werden diese Komplexe simulieren, um deren Flexibilität und den Einfluss des Lösungsmittels besser zu verstehen. QM/MM Reaktionsweg-Rechnungen werden zeigen, wie das Substrat am besten koordiniert werden muss.

S.Fischer & M.Karplus. Chem. Phys. Letters 194, 252 (1992).
S.M.Schwarzl, J.C.Smith & S.Fischer. In preparation.
C.M.Topham & J.C.Smith. J. Mol. Biol. 292, 1017 (1999).


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Stand: 24.06.09